准备工作:
解剖器械需提前灭菌,烤干;Neuralbasal培养;D-PBS缓冲液;0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液;0.05%poly-lysin。12孔板。
实验步骤:
1.海马组织分离:准备培养皿2个,分别加入冰冻D-Hank’s液约5ml,至于冰盘上;
2.取1-3天鼠,75%酒精浸泡片刻后,用大剪子断头处死。
3.取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中,最后用弯头显微镊由海马游离端仔细分离海马组织,并剔除血管及脑膜。
4.将组织块用弯头眼科剪剪碎,每小块约2mm3左右,用枪移入5mlEP中,稍为沉淀1分钟,吸弃上清,加入0.25%trypsin/0.02%EDTA,37℃消化10-15分钟左右。
5.机械吹打分散细胞,40μm筛网过滤,制成单细胞悬液,1000rpm室温离心6min,弃去上清液,加Starting medium,尖嘴吸管吹打分散细胞后,制成4×105个/ml的单细胞悬液,接种在培养板内。
6.2小时后补培养基0.5ml每孔。
7.接种72h后,加入含10μM阿糖胞苷的Culture Medium作用48h,以抑制胶质细胞的过度增殖。之后每隔两天用Culture Medium换液。